Universidad Autónoma
de Chiapas
Facultad de Ciencias
Químicas Ext. Ocozocoautla
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INTEGRANTES
DEL EQUIPO
Ariana
Archila Jimenez
Catherin
C. Pérez Sánchez
Yeudiel
Pérez López
Emmanuel
López
CATEDRATICO
Dra. Ana Olivia Cañas Urbina
SEMESTRE:
Segundo
MATERIA
Biología Celular
NOMBRE DEL TRABAJO
Practica 3 de Laboratorio de Biología Celular
TINCION DE GRAM
El peptidoglicano o mureina
es un copolímero formado por una secuencia alternante de N-acetil-glucosamina y
el Ácido N-acetilmuramico unidos mediante enlaces
-1,4. El peptidoglucano
es muy resistente y protege a las bacterias de una ruptura osmótica en ambientes
acuáticos y da a los tipos diferentes de bacterias sus formas.
La cedan es
recta y no ramificada. Constituye la estructura básica de la pared celular de
la pared celular de las eubacterias y de las Prochlorophyta. Las
arqueobacterias, al contrario no poseen mureina sino pseudopeptidoglucano
formado por N-acetil-glucosamina unida al N-acetiltalosaminomuramico mediante
enlace
MUREINA Y TINCION DE GRAM
GRAM POSITIVO
La red de mureina está muy desarrollada y llega a tener
hasta 40 capas.
Los aminoácidos que lo forman son distintos entre
especies.
Esta constituido de la estructura química de la mureina
es característica de la especie y constituye un buen parámetro taxonómico.
Los aminoácidos L-diaminopimelico o D-lisina son
relativamente frecuentes.
Los polisacáridos están unidos por enlaces covalentes (en
el caso de tenerlos).
El contenido proteico es bajo.
Alto contenido de lípidos.
Bajo contenido de amino azucares.
GRAM
NEGATIVO
La red de mureina presenta una sola capa.
La constitución de mureina es igual en todas las
bacterias Gram negativas.
Contiene siempre únicamente meso-diaminopimelico.
Nunca contiene lisina.
No hay puentes interpeptidicos.
Hay gran cantidad de lipoproteínas y lipopolisacaridos
que representan hasta el 80% del peso seco de la pared células.
Necesitan calcio para mantener la estabilidad de las
capas de lipopolisacaridos, lo que las hace vulnerables a la lisozima.
No se ha podido demostrar acidos teicoicos.
METODOLOGIA
Recoger muestra
Hacer el extendido con un palillo de madera
Dejar secar a temperatura ambiente o fijarla utilizando
un mechero
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor
(flameado tres veces aproximadamente)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de
genciana) y esperar un minuto
Enjuagar con agua
Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente
Enjuagar con agua
Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos
según la concentración del reactivo (parte crítica de la coloración). (las Gram
(-) se decoloran y las Gram (+) no)
Enjuagar con agua
Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica
y esperar un minuto. Este tiente dejara de color rosado – rojizo las bacterias
Gram negativas
Para observar al microscopio
óptico es conveniente hacerlo al 100 X con aceite de inmersión
EXPLICACION
El cristal violeta
(colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto gram
positivas como gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un
compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y SI
(Siulterio), los cuales están presentes para solubilizar el yodo y actúan de
mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la
pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en
solución acuosa en el cristal violeta.
La mezcla de alcohol –
cetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma
es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se
decoloran, mientras que los gram negativos si lo hacen.
Para poner de manifiesto las
células Gram negativas se utiliza una decoloración de contraste. Habitualmente
es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la
coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las
Gram positivas permanecen violeta.
La safranina puede o no
utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de
contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al termino del
protocolo, las Gram positivas se verán azul – violáceas y las Gram negativas,
se verán rosas (si no se hiso la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por
ejemplo, safranina).
Esta importante coloración
diferencial fue descubierta por Hans Christina Gram en 1884. En este método de
tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes
de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinad. Se
escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de
yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el
portaobjetos con alcohol hasta que este no arrastre más colorante. Sigue a tal
tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada
diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde malaquita.
Algunos microorganismos
retienen el colorante violeta, aun después de tratarlos con un decolorante y el
color no se modifica al añdir este; otros pierden con facilidad el primer tinte,
y toman el segundo. Los que fijan el violeta se califican de gram positivos y
los que pierden la primera coloración y retiene la segunda de gram negativos.
Basándonos pues, en la reacción gram, podemos clasificar a los microorganismos
en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores
resultados dan en la coloración gram. los representantes mas usados de este
grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad,
violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil – p –
rosanilina.
El matiz de color de la p –
rosanilina se intensifica al aumentar el numero de grupos metilo en la
molecula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono mas oscuro es la
hexametil – p – rosanilina (violeta cristal), y el tinte mas ligero, la
tetrametil – p – rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo
3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenidos.
La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de
cristal contiene seis grupos metilo y se considera como el mejor colorante
primario para teñir por el método de Gram.
La facultad de las células
para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos
y bacterias. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no
conservan la primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad;
los gránulos de micelios propenden detener el colorante. La reacción de Gram no
es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del
medio, y quizá por otras causas.
CONCLUSION
La
tinción de Gram es útil para diferenciar entre las bacterias que poseen una
capa gruesa de mureina o peptidoglicano de las que no, pues, quienes lo tienen se tiñen de violeta designándolos como
Gram positivos mientras que los Gram negativos se tiñen de rojo al tener una
capa más delgada de mureina.
Los
Gram negativos se tiñen de rojo gracias a la Safranina que se utilizó al final
del procedimiento, porque no se fijan las primeras sustancias
que utilizamos al principio del procedimiento que fue el Cristal Violeta
y el lugol, debido a que cuando se le coloca el alcohol acetona se “limpia”
nuevamente la muestra, y al aplicar la safranina adquiere fácilmente el color
rojo de la sustancia.
Podemos
fijar la muestra ya teñida al portaobjetos
pasándolo rápidamente sobre la llama de un mechero de bunsen cuidando no
calentar demasiado el portaobjetos para no quemar a las bacterias de la
muestra.
EVIDENCIAS
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